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如何提高電轉(zhuǎn)效率?

 更新時(shí)間:2023-09-14    點(diǎn)擊量:617

電轉(zhuǎn),也稱電穿孔法,是通過(guò)脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔,將外源分子(DNA、RNA 、mRNA等)導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi),來(lái)改變細(xì)胞的特性,從而達(dá)到改造細(xì)胞的目的,是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)研究的重要工具。那么該如何提高電轉(zhuǎn)效率呢?讓我們一起來(lái)看看吧!

一、細(xì)胞收集時(shí):

1)在消化貼壁細(xì)胞時(shí),一定要注意終止胰酶反應(yīng),防止過(guò)度消化;最好使用專業(yè)的胰酶中和劑;

2)在進(jìn)行細(xì)胞離心時(shí),使用低轉(zhuǎn)速長(zhǎng)時(shí)間離心,提升細(xì)胞的存活率;

3)選擇合適狀態(tài)的細(xì)胞,一般原代細(xì)胞可以傳1-2次后使用;盡量挑選迭代次數(shù)少的細(xì)胞,如果是凍存細(xì)胞,建議復(fù)蘇1-2h后使用;

4)選擇對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞;

5)做好支原體清除。

二、試劑添加:

1)電轉(zhuǎn)試劑的添加只需室溫操作即可;

2)細(xì)胞在試劑中停留不超20min,混合好盡快開(kāi)始實(shí)驗(yàn);

3)轉(zhuǎn)染的底物占比不能大于總體積的10%,比如轉(zhuǎn)染體系100ul,底物最多添加10ul;

4)在消化的細(xì)胞進(jìn)行配置時(shí),一定要離心并完quan去除殘留培養(yǎng)基;

5)在加入到電極杯中時(shí),要避免產(chǎn)生氣泡,從而影響電脈沖;

6)對(duì)底物進(jìn)行內(nèi)毒素控制;

7)轉(zhuǎn)染試劑與底物濃度配比控制;

8)如果是mRNA轉(zhuǎn)染,可多洗滌2次。

三、程序設(shè)置:

1)使用電轉(zhuǎn)儀,程序已經(jīng)設(shè)定好,可以根據(jù)不同的細(xì)胞名稱,選擇對(duì)應(yīng)的最you程序;根據(jù)實(shí)際情況,可以對(duì)程序進(jìn)行微調(diào),確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。

2)使用需要自行設(shè)置的儀器,一般電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置遵循低電場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程的原則。

四、細(xì)胞重懸:

1)轉(zhuǎn)染結(jié)束之后,可以先停留10min再加培養(yǎng)基重懸;

2)使用無(wú)鈣培養(yǎng)基重懸,5-10min后轉(zhuǎn)移細(xì)胞到培養(yǎng)皿上;

3)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)一般在轉(zhuǎn)染后24h再進(jìn)行;

4)電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞,鋪板數(shù)量翻一倍。

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