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022-66387942免疫共沉淀(CO-IP)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。那么你知道免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)操作有哪些嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
一、蛋白樣品制備
裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白樣品,以下為HEK293T細(xì)胞樣品的處理方法,其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/span>
1. 收集細(xì)胞:10cm細(xì)胞培養(yǎng)板上,每板細(xì)胞加1ml ,4℃預(yù)冷的PBS(0.01 M pH7.2~7.3)。反復(fù)沖洗把所有掛壁細(xì)胞洗下來(lái)轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管內(nèi) 離心:3400 rpm 2min。
2. 清洗細(xì)胞:棄上清,(大槍頭套小槍頭)避免吸到沉淀。再加1mPBS,垂懸吹打;離心:rpm3400 2min。棄上清,將PBS吸凈后-80℃保存。
3. 準(zhǔn)備Protein A agarose,用PBS 洗兩遍珠子,然后用PBS配制成50%濃度,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
4. 裂解蛋白,收集的細(xì)胞中加入1000ul細(xì)胞裂解液10ul蛋白酶抑制劑,冰上靜置30min,每10min震蕩混勻一次,4℃,12000rpm離心10min,收集上清液。
5. 每1 ml 總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃1 h以去除非特異性雜蛋白,降低背景。
6. 4℃,14000g離心15min,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中標(biāo)號(hào)Input,留Protein A珠子,標(biāo)號(hào)IP。
7. 變性以及還原蛋白
室溫溶解蛋白上樣緩沖液(5×),按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合,IP組加入50ul蛋白上樣緩沖液,在蛋白樣品中加入含SDS(保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致)的上樣緩沖液,100℃加熱煮沸,以充分變性蛋白。冰上驟冷,上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可。
二、經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離樣品
膠的選擇與制備(根據(jù)目的蛋白的大小,選擇合適的分離膠的濃度)
1. 凝膠的制備:根據(jù)目的蛋白的大小來(lái)選擇合適濃度的分離膠。目的蛋白小于20 k Da選擇12%~15%的分離膠;大于20 k Da選擇10%的分離膠, 濃縮膠一般固定為5%。
2. 上樣加入蛋白樣品,每孔加上樣液20ug,留一孔加預(yù)染的marker。
3. 加滿電泳緩沖液,蓋上槽蓋,接通電源,先用70V恒壓電泳,約30min,當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用90V恒壓電泳,當(dāng)指示劑到達(dá)距凝膠下端約0.5cm處時(shí)關(guān)閉電源,取出膠板。
三、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育
將蛋白凝膠中的蛋白,通過(guò)電流作用轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上。
1. 將剪好的PVDF膜用無(wú)水甲醇潤(rùn)濕30秒以上,然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5min后開(kāi)始后續(xù)操作。
2. 裝配轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)(在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產(chǎn)生)
黑面(負(fù)極)→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉(zhuǎn)印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面(正極),每層之間不能有氣泡。然后將三明治轉(zhuǎn)移至電泳槽中,黑面對(duì)黑面。
3. 加入轉(zhuǎn)膜緩沖液,將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中,300mA恒流轉(zhuǎn)膜60-90min。
4. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,使用5% 脫脂奶粉室溫封閉1h。
5. 選擇合適的一抗孵育,室溫?fù)u動(dòng)1h。
6. 孵育二抗,4℃孵育2h或室溫(22-25℃)搖動(dòng)孵育1h。(抗體查相應(yīng)說(shuō)明書(shū)確定稀釋倍數(shù))
四、顯影
1. 配置稀釋液,將A液和B液按照(1:1)混合。
2. 從TBST緩沖液中取出膜,去除膜上的多余緩沖液,但不要讓膜干燥。
3. 將有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張紙板上,加上配好的工作稀釋液。用量以覆蓋住膜為基準(zhǔn)。
4. 將膜與工作稀釋液孵育1-5min,確保整個(gè)表面覆蓋。
5. 去除多余的液體,用保鮮膜包好PVDF膜,暗室中X膠片感光顯影定影。
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