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一、瓊脂糖凝膠的特點
核酸分子是兩性解離分子,在高于其等電點的電泳緩沖液中,其堿基不解離,而磷酸基團全部解離,核酸分子因而帶負電荷,電泳時向正極遷移。
瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來并經(jīng)糖基化修飾,為一種聚合鏈線性分子,使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì),發(fā)揮分子篩功能,使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異,從而達到分離的目的。
因此,目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳,其優(yōu)點如下。
(1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單,電泳速度快,樣品不需事先處理就可以進行電泳。
(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻,含水量大(約占 98%~99%),近似自由電泳,樣品擴散較自由電流,對樣品吸附極微, 因此電泳圖譜清晰,分辨率高,重復(fù)性好。
(3)瓊脂糖透明無紫外吸收,電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
(4)電泳后區(qū)帶易染色,樣品極易洗脫,便于定量測定。制成干膜可長期保存。
二、DNA 的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型,同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
1. 核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
(1)DNA分子的大小在凝膠中,DNA 片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數(shù)成反比,因此通過已知大小的標(biāo)準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較,便可測出未知片段的大小。
(2)瓊脂脂糖的濃度 如下表所示,不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
2. 同構(gòu)型 DNA 的移動速度次序為:供價閉環(huán) DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直線 DNA>開環(huán) 的雙鏈環(huán)狀 DNA。
當(dāng)瓊脂糖濃度太高時,環(huán)狀 DNA不能進入膠中,相對遷移率為 0(Rm=0),而同等大小的直線雙鏈 DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm>0),由此可見,這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度,但同時,也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
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