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022-66387942 檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞的生理活性是掌握生物體骨代謝狀態(tài)的有效方法。骨組織使用堿性磷酸酶(ALP)進(jìn)行染色可明確成骨細(xì)胞的成骨潛能,使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色可明確破骨細(xì)胞的骨吸收能力。并且在同一切片上進(jìn)行二重染色時(shí),可同時(shí)識(shí)別二者
正常的骨代謝是通過成骨細(xì)胞生長(zhǎng)與破骨細(xì)胞建立骨吸收而維持平衡。成骨細(xì)胞的標(biāo)記酶是堿性磷酸酶(ALP)。破骨細(xì)胞的標(biāo)記酶是抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)。這兩種標(biāo)記酶在組織切片或者培養(yǎng)細(xì)胞過程中,被作為成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞存在的標(biāo)記指標(biāo)。
TRAP/ALP破骨成骨雙重染色試劑盒可通過骨組織切片以及培養(yǎng)細(xì)胞中TRAP/ALP酶活性進(jìn)行組織染色。通過觀察成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的染色成像,可檢查細(xì)胞的分化狀態(tài)和骨組織的分布情況。
一、特點(diǎn):
使用時(shí)混合3種溶液,可制備TRAP酶活性染色的顯色底物溶液。
ALP酶活性染色使用的是預(yù)混物溶液,操作簡(jiǎn)便。
TRAP的活性部位呈紅紫色,ALP的活性部位呈藍(lán)色(茶褐色),可雙重染色。適用于骨組織切片(脫鈣GMA樹脂包埋切片)以及培養(yǎng)細(xì)胞。
二、染色方法
染色法是Lorch的Gomori法。使用的是偶氮染料法和耦合法結(jié)合的TRAP/ALP染色試劑盒。Lorch推薦切片厚度為8μm,同時(shí)也研究了普通的4μm切片是否能染色、雙重染色的順序應(yīng)該先染TRAP和ALP中的哪一個(gè)、封片劑是否必須選水溶性封片劑等問題。
染色法結(jié)果:偶氮染料法中切片過厚導(dǎo)致酶擴(kuò)散圖像。即用TRAP染色骨質(zhì)有紅染傾向,但即使是4μm厚度,只要增強(qiáng)反應(yīng)條件(反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間),也能充分染色的。換言之,TRAP染色中反應(yīng)溫度從室溫調(diào)至37℃,反應(yīng)時(shí)間從30分鐘調(diào)至45分鐘或60分鐘。ALP染色在37℃反應(yīng)45分鐘至3小時(shí),或者室溫(10-15℃)下反應(yīng)時(shí)間增加至一晚。此結(jié)果顯示,兩者色調(diào)平衡,染色效果好。但是,反應(yīng)條件的增強(qiáng)導(dǎo)致ALP染色切片產(chǎn)生了很多色素顆粒。另外,TRAP和ALP的染色順序哪一個(gè)先染色都是可以的。如果先進(jìn)行ALP染色時(shí),在TRAP陽性部位呈明顯的紅色,鮮艷處為破骨細(xì)胞。獲得比較好的標(biāo)本。但是,ALP的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過TRAP溶液處理后,會(huì)產(chǎn)生白色混濁顆粒,沉淀在組織上。因此,先TRAP染色,接著ALP染色的方法是可行的。封裝法是利用甲基綠數(shù)秒間核染色處理。水洗后,37℃下干燥,二甲苯浸透,用馬里醇(Marinol)永jiu封存。
脫鈣石蠟包埋切片的TRAP/ALP雙重染色
用1年齡小鼠腰椎的EDTA脫鈣石蠟切片,進(jìn)行TRAP/ALP雙重染色。
TRAP陽性將破骨細(xì)胞染成紅色,ALP陽性將細(xì)胞活性強(qiáng)的細(xì)胞(成骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞)染成褐色。(上:弱擴(kuò)大,下:強(qiáng)擴(kuò)大)
TRAP和ALP的雙酶染色實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)固定、脫鈣、染色進(jìn)行多處改良,實(shí)現(xiàn)了對(duì)脫鈣石蠟標(biāo)本的染色。但是酶擴(kuò)散圖像對(duì)TRAP染色的效果ji佳。出于各種原因的考慮,關(guān)于固定步驟的影響,如果固定不充分的話,容易抑制脫鈣水平。進(jìn)而導(dǎo)致酶擴(kuò)散的發(fā)生。另外,注意脫鈣本身的影響也是有必要的??偠灾头敲撯}標(biāo)本相比較,脫鈣標(biāo)本的擴(kuò)散圖像更加明顯。脫鈣會(huì)使酶擴(kuò)散變強(qiáng)。
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